L’OMOCISTEINA:
PROBLEMI METODOLOGICI PREANALITICI E ANALITICI
Lepori M., Braccini L.,
Cesaretti S., Anichini M.
INRCA Laboratorio Analisi Firenze
La determinazione dell’omocisteina può essere eseguita sul
plasma o sul siero. C’è differenza tra i valori che si ottengono usando l’uno o
l’altro. La ragione di questa discrepanza è la cessione di omocisteina da parte dei
globuli rossi in un campione lasciato a riposo. Per standardizzare è necessario precisare
le modalità del prelievo, secondo noi è più corretto utilizzare il plasma (EDTA) in
modo da centrifugare immediatamente il campione. Poichè si è visto che la cessione di
omocisteina dai globuli rossi è, oltre che tempo dipendente, temperatura dipendente si
opera a 4° C. Si ha cura di centrifugare a 4° C il plasma e se non viene avviato subito
all’analisi si stocca a -20°C. L’omocisteina è presente nel sangue come
disolfuro misto omocisteina-cisteina e in maggior parte legata alle proteine. Ogni tecnica
di analisi come primo passo deve ridurre (DTT, DTE, MTE, NaBH4; TNBP) per
liberare l’omocisteina e rendere possibili le successive reazioni. Le tecniche
impiegate sono: GC-MS; HPLC; immunologiche.
La tecnica GC-MS consiste dopo la riduzione, nell’estrazione in
fase solida, nell’essiccazione sotto vuoto, nella derivatizzazione,
nell’iniezione del GC capillare e nella rivelazione mediante spettrometria di massa.
Il metodo richiede la preparazione manuale dei campioni (circa 3 ore) e solo
l’iniezione può essere automatizzata. Con questo metodo sensibile e specifico si
può contemporaneamente determinare cistationina, metionina, cisteina, N-metilglicina, N,
N-dimetil-glicina. Naturalmente il limite è la disponibilità di uno spettrometro di
massa. I metodi immunologici sono radioenzimatici o immunoenzimatici; ovviamente varia la
tecnica di rivelazione, ma il principio utilizzato è lo stesso: in entrambi i casi dopo
riduzione con DTE o DTT si converte l’omocisteina in S-adenosil-omocisteina. Nel RIA
si separa la sostanza con HPLC o con TLC e poi si rivela utilizzando la presenza di un
isotopo radioattivo. Nell’EIA si ha una reazione di competizione tra
S-adenosil-L-omocisteina presente nel campione e la stessa sostanza legata nei pozzetti
della piastra, per i siti leganti di un anticorpo anti S-adenosil-omocisteina presente in
difetto, segue la solita reazione di rivelazione. Le tecniche più usate sono in HPLC. Si
seguono varie vie: derivatizzazione precolonna dell’omocisteina; separazione in fase
inversa e rivelazione fluorimetrica; separazione dei tioli liberi e rivelazione
elettrochimica; separazione con scambio ionico; derivatizzazione postcolonna e successiva
rivelazione. La tecnica più usata è la prima consistente in riduzione, derivatizzazione
dei tioli (mBrB, SBD-F, SBD-A, OPA) deproteinizzazione (PCA, TCA), rivelazione con
eluizione usando una fase inversa. Per l’uso della rivelazione elettrochimica con
elettrodi di amalgama Hg/Au si può dire che c’è un’alta specificità per i
gruppi - SH, non c’è bisogno di derivatizzare e quindi sarebbe più rapido, più
semplice e facilmente automatizzabile con la possibilità di dosare altri tioli, però ci
sono, problemi di contaminazione della cella a flusso e di deterioramento
dell’elettrodo.
Noi abbiamo usato riduzione con TNBP, derivatizzazione con SBD-F,
deproteinizzazione con TCA, separazione in fase inversa e rivelazione fluorimetrica.
Nella casistica da noi esaminata (n° = 108) i valori aumentano con
l’età, nel deficit di acido folico e con la riduzione del filtrato glomerulare.
| N° 46 pazienti di età compresa tra anni 40 e 72 |
omocisteina 6,59+2 m M |
| N° 62 pazienti di età compresa tra anni 90 e 106 |
omocisteina 13.23+7.07 m M |
 Indice "STROKE /
Fattori di Rischio"
Indice STROKE
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